Enamiku viiruste genoomsed järjestused on teada.Nukleiinhappesondid, mis on lühikesed DNA segmendid, mis on loodud hübridiseeruma komplementaarse viiruse DNA või RNA segmentidega.Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on tõhusam meetod viiruse tuvastamiseks.Hiljuti on välja töötatud suure läbilaskevõimega diagnostikameetodid.
A. Nukleiinhapete hübridisatsioonitehnika
Nukleiinhapete hübridisatsioon, sealhulgas peamiselt Southern blotting (Southern) ja Northern blotting (Northern), on viirusdiagnostika valdkonnas kiiresti arenev uus tehnika.Hübridisatsioonitesti eesmärk on kasutada DNA lühikesi segmente (nimetatakse "sondiks"), mis on loodud hübridiseeruma komplementaarsete viiruse DNA või RNA segmentidega.Kuumutamise või aluselise töötlemisega eraldatakse kaheahelaline sihtmärk-DNA või RNA üksikuteks ahelateks ja seejärel immobiliseeritakse tahkele alusele.Pärast seda lisatakse sond ja hübridiseeritakse sihtmärk-DNA või RNA-ga.Kuna sond on märgistatud isotoobi või mitteradioaktiivse nukliidiga, saab sihtmärk-DNA või RNA tuvastada autoradiograafia või biotiini-avidiini süsteemi abil.Kuna enamik viiruse genoome on kloonitud ja sekveneeritud, saab neid tuvastada, kasutades proovis sondidena viirusspetsiifilisi järjestusi.Praegu hõlmavad hübridisatsioonimeetodid: dot blot, in situ hübridisatsiooni rakkudes, DNA blot analüüsi (DNA) (Southern blot) ja RNA blot analüüsi (RNA) (Northern blot).
B.PCR tehnoloogia
Viimastel aastatel on tundetute või kultiveerimatute viiruste testimiseks välja töötatud rida in vitro nukleiinhapete amplifikatsioonimeetodeid, mis põhinevad PCR-il.PCR on meetod, millega saab sünteesida spetsiifilist DNA järjestust in vitro polümeraasi reaktsiooniga.PCR-protsess sisaldab kolmest etapist koosnevat termilist tsüklit: denatureerimine, anniilimine ja pikendamine. Kõrgel temperatuuril (93℃~95℃) eraldatakse kaheahelaline DNA kaheks üksikuks DNA ahelaks;seejärel madalal temperatuuril (37 ℃ ~ 60 ℃) kaks sünteesitud nukleotiidpraimerit liituvad komplementaarsete DNA segmentidega;samas kui Taq ensüümi jaoks sobival temperatuuril (72 ℃) algab uute DNA ahelate süntees praimeri 3' otsast, kasutades matriitsina komplementaarset DNA-d ja materjalidena üksikuid nukleotiide.Nii et pärast iga tsüklit saab ühe DNA ahela amplifitseerida kaheks ahelaks.Seda protsessi korrates saab iga ühes tsüklis sünteesitud DNA ahelat kasutada järgmises tsüklis matriitsina ja DNA ahelate arv kahekordistub igas tsüklis, mis tähendab, et PCR produktsioon amplifitseeritakse 2n logaritmilise kiirusega.Pärast 25–30 tsüklit tuvastatakse PCR tootmine elektroforeesi abil ja spetsiifilisi DNA saadusi saab jälgida UV-valguses (254 nm).Spetsiifilisuse, tundlikkuse ja mugavuse eeliseks on PCR kasutusele võetud paljude viirusnakkuste, nagu HCV, HIV, CMV ja HPV, kliinilises diagnoosimises.Kuna PCR on väga tundlik, see suudab tuvastada viiruse DNA-d fg tasemel, tuleb toimingut teha väga ettevaatlikult, et vältida valepositiivseid tulemusi.Lisaks ei tähenda nukleiinhappetesti positiivne tulemus, et proovis on elus nakkusviirus.
PCR-tehnika laialdase rakendamisega töötatakse välja uued PCR-tehnikal põhinevad tehnikad ja meetodid erinevatel katsetel.Näiteks võib reaalajas kvantitatiivne PCR tuvastada viiruskoormuse;in situ PCR-i kasutatakse viirusinfektsiooni tuvastamiseks koes või rakkudes;Pesastatud PCR võib suurendada PCR-i spetsiifilisust.Nende hulgas on reaalajas kvantitatiivne PCR välja töötatud kiiremini.Paljud uued tehnikad, nagu TaqMani hüdrolüüsisond, hübridisatsioonisond ja molekulaarmajaka sond, on kombineeritud reaalajas kvantitatiivseks PCR-tehnikaks, mida kasutatakse laialdaselt kliinilistes uuringutes.Lisaks patsientide kehavedeliku viiruskoormuse täpsele tuvastamisele saab seda meetodit kasutada ka ravimtolerantse mutandi tuvastamiseks.Seetõttu kasutatakse reaalajas kvantitatiivset PCR-i peamiselt ravitoime hindamisel ja ravimitaluvuse jälgimisel.
C. Viiruslike nukleiinhapete suure läbilaskevõimega tuvastamine
Uute esilekerkivate nakkushaiguste kiire diagnoosimise vajaduste rahuldamiseks on loodud mitmesugused suure läbilaskevõimega tuvastamismeetodid, nagu DNA kiibid (DNA).DNA kiipide jaoks sünteesitakse spetsiifilised sondid ja kinnitatakse väikeste ränikiibide külge väga suure tihedusega, et moodustada DNA sondi mikrokiip (DNA), mida saab prooviga hübridiseerida.Hübridisatsioonisignaali saab pildistada konfokaalse mikroskoobi või laserskanneriga ja arvutiga edasi töödelda ning saada tohutuid andmeid erinevate geenide kohta.DNA-kiipe on kahte tüüpi."Sünteesikiip" on järgmine: spetsiifilised oligonukleotiidid sünteesitakse otse kiipidel.Teine on DNA kogumi kiip.Kloonitud geenid või PCR-produktid prinditakse slaidile.DNA kiibi tehnoloogia eeliseks on suure hulga DNA järjestuste samaaegne tuvastamine.Patogeeni tuvastamise kiibi uusim versioon suudab korraga tuvastada üle 1700 inimese viiruse.DNA kiibi tehnoloogia lahendas traditsiooniliste nukleiinhapete hübridisatsioonimeetodite probleemid ja sellel on väga laialdased rakendused viirusdiagnostikas ja epidemioloogilises uuringus.
Postitusaeg: 23. detsember 2020